ÖZET:

Kanser kök hücreleri (CSC’ler), son on yılda yapılan çalışmalardan kanıtlandığı üzere, kanser araştırmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Zaman geçtikçe etkili kanser tedavisi geliştirilmiş olsa da, şimdiye kadar kanser dünya çapında en yüksek ikinci ölüm oranına sahiptir. Her terapi başarısızlığı için tanımlanan tek özellik, heterojen tümör popülasyonunda kanser kök hücreleri olarak bilinen kendi kendini yenileme kapasitesine sahip hücrelerin varlığıdır. Bu CSC’ler, kemoterapi ve radyoterapi gibi çeşitli tedavilere karşı bir tümör direnci sağlar. Bu nedenle kanser hastalarının yaşam süresini uzatmak için CSC popülasyonunu ortadan kaldırmak ön koşuldur. Böylece, primer tümörlere karşı yeni etkili terapötikler geliştirmek için, CSC’lerin izolasyonu ve karakterizasyonu, kanser terapötiklerinin geliştirilmesi için yeni bir anlayış sağlayacaktır. Bu nedenle, CSC’leri izole etmek ve hedeflemek için çeşitli in vitro ve in vivo yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu bölümde, araştırmacıların, CSC’leri ve dolayısıyla kanseri hedeflemek için daha iyi terapötikler geliştirmek için CSC’leri karakterize etmek için çeşitli güçlü araçları nasıl geliştirdiklerini ve ayrıca teknolojinin insan tümörlerinin gelişmiş klinik öncesi modellerini oluşturmak için nasıl ortaya çıktığını tartışacağız.

Anahtar Kelimeler:

Kanser kök hücreleri (CSC’ler) · Sferoidler · Organoidler

Şekil. 14.1: Tümör hücresi proliferasyonu için modeller. (a) Stokastik model: Bu model, her hücrenin çoğalma potansiyeline sahip olduğunu ve kök hücre gibi davrandığını öne sürer. (b) Kanser kök modeli: Bu modele göre, hücrenin yalnızca alt kümesi, tüm tümörü oluşturabilen kendi kendini yenileme kapasitesine sahiptir. Bu farklı hücre alt popülasyonu, kanser kök hücreleri olarak bilinir.

14.1: Giriş

Yoğun deneysel yaklaşımlardaki ilerlemelere ve kanser tedavisindeki ilerlemeye rağmen, kanser hala en yüksek ikinci ölüme neden olmaktadır. [1]. Karsinogenezin gelişim mekanizmasına ilişkin derin bir kavrayış, kanser araştırmalarına ve tedavisine doğru bir kaymaya neden olmuştur. Önceden, ilaç direncini indükleyen genetik ve biyokimyasal mekanizmalara çok dikkat edildi. Hakim teoriler, tümörün heterojen hücre popülasyonundan oluşan homojen bir malign hücre kütlesi olmadığını bildirmiştir. Karsinogenez sırasında, tedavi başarısızlığının öncelikle intratümöral heterojenlikten kaynaklandığı iyi bilinmektedir. Bir tümör içinde bulunan hücrelerin bir alt popülasyonu, kemoterapi ve radyoterapiye karşı direncin oluşumundan ve tümör nüksetmesinin köklerinden sorumludur. Bu küçük hücre popülasyonları, kanser kök hücreleri (CSC’ler) olarak bilinir ve tümörün nüksetmesine neden olan tedavilerden sonra yeniden çoğalabilir [2]. Tümör ilerlemesi, stokastik model (Şekil 14.1a) ve kanser kök hücre modeli (Şekil 14.1b) olmak üzere iki model tarafından iyi açıklanmıştır. Stokastik model, klonal evrim modeli olarak bilinir. Stokastik modele göre, tümörün tüm hücreleri, kontrolsüz çoğalma potansiyeli olan karsinojenik potansiyele sahiptir ve terapötik tedavi, tüm tümörlü hücrelerin hedeflenmesini gerektirir [3, 4]. Kanser kök hücre modeli, tümörün kendi kendini yenileme kapasitesine sahip, kemoterapi ve radyoterapiye dirençli bir kök hücreden kaynaklandığını belirtir [5]. Tümörün bu alt popülasyonları, tüm tümörü sürme yeteneklerinden dolayı kanser kök hücreleri (CSC’ler) olarak bilinir ve bu hücreler tümörün nüksetmesine neden olur [5]. CSC’ler, tümörün başlatılması, ilerlemesi, sürdürülmesi, metastaz gelişimi ve yeniden ortaya çıkması ile ilgilidir. Bu nedenle, CSC popülasyonunu tümörden özel olarak hedeflemek ve ortadan kaldırmak, tümör nüksetmesini duraklatabilen ve uzun süreli bir tedavi olarak sürdürülebilen etkili bir tedavi stratejisi olabilir [5].

14.2: Kanser Kök Hücre Modelleri

CSC’leri inceleyerek çeşitli tümör biyolojisi soruları cevaplanabilir. Bir tümör popülasyonundaki CSC’ler, kendini yenileme potansiyeline sahip ve multipotent olan hücreler olarak tanımlanabilir. Hücreler gibi kanser kök hücrelerinin tanımlanması ve miktar tayini, in vitro veya in vivo deneylerle yapılabilir.

14.3: In Vivo Testleri

14.3.1:Ksenotransplantasyon Testi

 14.3.1.1: Şiddetli Kombine İmmün Yetmezlikli (SCID) Fareler

Bağışıklığı baskılanmış fareler, CSC’leri incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. SCID fare modeli ilk olarak akut miyeloid lösemiyi (AML) incelemek için “lösemik kök hücrelerin (LSC’ler)” geliştirilmesi için araştırıldı. Akut miyeloid lösemi sırasında, hücreler düşük çoğalma kapasitesi ile sınırlandırılır, bu da lösemik klonların nadir görülen kök hücre popülasyonu tarafından korunduğunu gösterir [6]. Lapidot ve ark. [6], SCID fare modelini kullandılar ve CD34+ CD38—, CD34+ CD38+ ve CD34— CD38+ ifade eden farklı hücre popülasyonunu aşıladılar, bu da yalnızca CD34+ CD38— ifade eden hücreler tarafından lösemi gelişmesiyle sonuçlandı. Ayrıca 2.5 106 hücreden 1’inin lösemik greft oluşturma potansiyeline sahip olduğu gözlendi [1, 6]. Bu çalışma, tüm AML hücrelerinin tümör oluşumu için potansiyele sahip olmadığına dair bir kanıt sağladı, ancak SCID farelerini kullanmanın sınırlaması, izole edilmiş LSC’lerin sıklığının çok düşük olmasıydı.

14.3.1.2: Obez Olmayan Diyabetik, Şiddetli Kombine İmmün Yetmezlikli (NOD/SCID) Fareler

İnsan malign melanomu, SCID fare modelinden daha fazla bağışıklığı baskılanmış NOD/SCID fare modeli kullanılarak incelenmiştir [7]. NOD/SCID farelerinde insan melanom hücrelerinin ksenotransplantasyonu, milyon hücreden sadece bir tümörijenik hücrenin tanımlanmasıyla sonuçlandı [7]. Araştırmacılar ayrıca, NOD/SCID farelerine nakledildiğinde çoğu kanserin tümörijenik hücrelerin %0.1’inden daha azına sahip olduğunu gözlemlediler [7, 8]. NOD/SCID tahlillerinin tümör oluşturan hücrelerin sıklığını yetersiz tahmin edip etmediği sorgulandı [8, 9]. Bu nedenle, kanser kök hücrelerinin tespit ve izolasyon sayısını artırabilecek verimli bir model geliştirme talebiydi. Bu sorunu çözmek için NOD/SCID IL2Rγnul modeli kullanıldı [8].

14.1.1.3: NOD/SCID IL2Rgnull Faresi

NOD/SCID IL2Rγnull fareler, interlökin-2 (IL-2) reseptör gama zinciri ve doğal öldürücü hücrelerden yoksun olan ve yüksek oranda bağışıklığı baskılanmış fare modelidir [10]. Quintana ve al, melanom hücrelerinin NOD/SCID IL2Rγnul farelerine transplantasyonunun, artan sayıda tümörijenik hücrenin saptanmasıyla sonuçlandığını gösterdi [8]. Bu modeli kullanarak, araştırmacılar melanom hücrelerinin %25’inden in vivo olarak yeni tümör üretebildiler. Bu, 1.090.000’de 1 olan NOD/SCID farelerinin tümör başlatma potansiyeline kıyasla oldukça yüksekti; NOD/SCID IL2Rγnull’da tümör oluşturma kapasitesi olan 9 melanom hücresinden 1’iydi [10].

Bu model daha sonra birçok araştırmacının tercihi oldu. Örneğin, AML hücreleri NOD/SCID IL2Rγnull farelerinde ksenotransplante edildi ve bu, çok az sayıda 103 kemik iliği hCD34+hCD38- hücresinde uzun süreli aşılama, kendi kendini yenileyen LSC’lerin varlığıyla sonuçlandı, ancak hCD34+hCD38+ veya hCD34- hücrelerinde görülmedi. [11]. Ishizawa ve arkadaşları, insan pankreas, akciğer karsinomu ve baş ve boyun kanseri için NOD/SCID ve NOD/SCID IL2Rγnull fareler arasında karşılaştırmalı bir çalışma yaptı [12]. İncelenen tüm tümörler için, NOD/SCID IL2Rγnull farelerinde tümörijenik hücreler için yaklaşık on kat yükselme tespit edildi [12].

14.3.1.4: Ksenotransplantasyon Testlerinin Sınırlandırılması

Kanser kök hücrelerinin ksenotransplantasyon tahlili ve sınırlandırıcı seyreltme analizi kullanılarak in vivo tespitinde birçok teknik hata vardır. Bu hatalar, murin mikroçevresi ve nakledilen bölgedeki yetersiz bağışıklık tepkisi ve ayrıca alıcı fare suşunun cinsiyeti nedeniyle oluşur. Bu faktörler, bilim insanlarını kanser kök hücrelerini incelemek için daha doğru bir yaklaşım geliştirmeye zorladı ve genetiğiyle oynanmış fare modellerinin (GEMM) kullanılmasına yol açtı.

Şekil. 14.2 Soy izleme deneyi. Soy izleme testinin şematik gösterimi. İlk adım, bigenik hattın kurulmasını içerir. İkinci adım, onkojenik olayın indüksiyonunu içerir ve bunu, sonucun analizinin yapıldığı üçüncü adım takip eder.

14.3.1.5: Soy İzleme Testi

Soy izleme deneyinde (Şekil 14.2), farklı hücreleri etiketlemek için farklı hücreye özgü promotörler kullanılır, bu da tek hücrelerin izlenmesini sağlar [13]. Soy izleme tahlilinde çeşitli adımlar yer alır. İlk adım, bigenik fare çizgisi oluşturmaktır (Şekil 14.2a). Bijenik fare çizgisi, indüklenebilir bir Cre (Cre rekombinazını eksprese eden) ile hücrelerin etiketlenmesine yardımcı olan bir raportör (haberciyi eksprese eden) ile çaprazlanarak oluşturulur [13]. İkinci adım, Myc, Tcf ve Ras gibi onkogenleri veya p53, PTEN ve Rb gibi silinmiş tümör baskılayıcı genleri aşırı eksprese eden üçüncü geleneksel Tg hattı ile oluşturulan bigenik farenin çaprazlanmasıyla onkogenlerin eklenmesini veya tümör baskılayıcı genlerin silinmesini içerir (Şekil 1a). 14.2b) [13]. Onkogenlerin Tg hattı kullanılarak eksprese edilmesine rağmen, onkojenik olayı indüklemek için kimyasal karsinojenler de kullanılabilir. En yaygın olarak kullanılan kanserojen DMBA’dır (7,12-dimetilbenz[a]antrasen). Tümör oluşumunun son adımlarında etiketli hücrelerin takibi yapılır. Tüm hücreler raportör pozitifse, bu hücrelerin tümör yeniden doldurma kapasitesine sahip olduğunu gösterir (Şekil 14.2c). Böylece seri transplantasyon yapmak için bu hücrelerin saflaştırılması yapılır ve ardından CSC’ler izole edilir. Ancak, hücrelerin çoğunluğu raportör negatifse, bu, hücrelerin CSC özelliklerine sahip olmadığını gösterir. Soy izleme deneyi hız kazanmıştır ve genetiğiyle oynanmış fare modellerinin (GEMM) kullanımını kullanan bu tahlil kullanılarak çeşitli çalışmalar yapılmıştır [14].

Örneğin, Chen ve ark. glioblastoma multiforme (GBM) için bir soy izleme çalışması gerçekleştirdi. Bu çalışma, endojen glioma hücrelerinin hareketsiz alt kümesinin, tümörün korunmasından ve kemoterapiden sonra GBM’nin nüksetmesinden sorumlu olduğunu göstermiştir [15]. Hem yetişkin NSC’leri (nöral kök hücreler) hem de endojen glioma tümör hücrelerini etiketleyen bir Nestin-ΔTK-IRES-GFP (Nes-ΔTK-GFP) transgeni kullandılar. Bu Nes-ΔTK-GFP, glioma eğilimli bir fare hattı olan Mut7 hattı ile çaprazlanmıştır [16]. Bu Mut7 fare çizgisi, üç tümör baskılayıcı genin, yani PTEN, p53 ve Nf1’in silinmesiyle oluşturulur [15]. Ortaya çıkan Mut7 fareleri, silinmiş PTEN, p53 ve NF1 tümör baskılayıcı genleri olan glioblastoma geliştirdi [15]. Bu Mut7;Nes-ΔTK-GFP tümör hücreleri ayrıca Sox2’yi eksprese etti ve iki hücre popülasyonuna sahipti. Hücrelerin bir alt kümesi GFP+/Sox2+/ki-67— ve GFP—/ki—67+ ifade etti. Temozolomid ile tedavi, aktif olarak bölünen GFP-/ki-67+ tümör hücrelerini elimine etti ve tümör nüksetmesinden sorumlu hareketsiz hücrelerin bir kısmı GFP+/Sox2+/ki-67- geride kaldı. GFP+ hücreleri, gansiklovir tarafından hedeflenebilir; bu nedenle, gansiklovir uygulaması, uzamış sağkalım ve temozolomid ile gansiklovirin geciktirdiği tümör büyümesinin birlikte uygulanmasıyla birlikte tümör büyümesini önemli ölçüde azaltmıştır [15]. Bu soy izleme çalışması, tümör nüksetmesinden sorumlu olan uyuyan endojen glioblastoma hücrelerinin GFP+/Sox2+/ki-67’nin CSC özelliklerine sahip olduğunu ve uzun süreli tümör büyümesinden sorumlu olduğunu göstermiştir [14].

Bağırsak adenomlarında kök hücrelerin varlığına ilişkin işlevsel bir kanıt, Schepers ve ark. [17]. Bu çalışmada, çok renkli Cre muhabiri R26R-Confetti fare suşu kullandılar. Lgr5EGFP-Ires-CreERT2/Apcfl/fl farelerini R26R-Confetti suşu ile geçtiler ve tamoksifen enjeksiyonu Lgr5-GFPhi ve Lgr5-GFPlow oluşumuyla sonuçlandı. Gen ekspresyonu ve klonojenik potansiyel analizi, Lgr5-GFPhi’nin multipotent kök hücre özelliklerine sahip olduğunu gösterdi ve bu hücrelerin izlenmesi, bu hücrelerin tek adenom kök hücrelerinden elde edildiğini gösterdi [17].

Driessens ve diğerleri tarafından yapılan bir başka soy izleme çalışması. cilt papillomları oluşturmak için kimyasal iki aşamalı bir karsinogenez modeli kullanmıştır [18]. Bigenik fare suşu K14CreER/Rosa-YFP, K14-tahrikli CreER hattının Rosa26-YFP raportör hattı ile çaprazlanmasıyla elde edildi. Tamoksifen enjeksiyonu ile K14 eksprese eden keratinositler YFP+ hücreleri olarak etiketlenecektir [18]. Hem DMBA hem de tamoksifenin uygulanması, YFP+ hücrelerinin üretilmesiyle sonuçlandı ve hücrelerin çoğunluğu sınırlı çoğalma kapasitesine sahipken, bir kısmı kök hücre benzeri özelliklere sahipti. Klonların konfokal analizi, papillomların, kök hücreler gibi özelliklere sahip küçük tümör hücreleri popülasyonu tarafından sürdürüldüğünü gösterdi [18].

14.3.1.6: İzleme Testinin Sınırlamaları

Soy izleme, yalnızca fare modeli kullanılarak gerçekleştirilebilir ve insan ve fare hücrelerinde/organlarında çeşitli temel farklılıklar mevcuttur. Örneğin, fare prostatı insanlarda bulunmayan 4 lob’a bölünmüştür ve ayrıca fare hücreleri, insan prostat bezinin önemli bir molekülü olan PSA’yı eksprese etmez. Diğer bir fark, fare hücrelerinin yüksek telomeraz aktivitesi ifade etmesidir; bu, fare hücrelerinin asla gerçek terminal farklılaşmasına uğramayabileceğini gösterir. Bu nedenle, fare modelleri kullanılarak elde edilen sonuçlar doğrudan insan sistemini yansıtmayabilir [14].

14.3.2 In Vitro Testler

14.3.2.1: Yan Popülasyon Testi

Yan popülasyon tahlili, kanser kök hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için kullanılmıştır (Şekil 14.3) [13]. SP testi Goodell ve mulligan tarafından geliştirilmiştir [19, 20]. Araştırmacılar tarafından, Hoechst 33342 için zayıf şekilde boyanmış murin kemik iliği hücrelerinde ayrı bir popülasyonun var olduğu gözlemlenmiştir. Bu hücreler, akış sitometrisi nokta grafiğinde ayrı bir pozisyon işgal etmiş, dolayısıyla yan popülasyonlar olarak adlandırılmıştır [21]. Hoechst boyasının yan popülasyon tarafından hariç tutulması, CSC’lerin özel bir özelliğidir. İlginç bir şekilde, Hoechst boyasının akışı ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcısından kaynaklanıyordu. ABC taşıyıcısı, peptitler, kolesterol ve safra asitleri gibi birçok küçük endojen molekülü dışarı atmak için ATP kullanır. Bu taşıyıcılar, hücrelerin detoksifikasyonuna yardımcı olur ve ayrıca CSC’lere kanser kök hücre benzeri özelliklere katkıda bulunur. ABC taşıyıcıları, kemoterapötik ilaçlar da bu pompalar için substratlar olduğundan ve ilaçların akışı ABC taşıyıcıları tarafından meydana geldiğinden, CSC’lerde kemorezistansı indükler [21].

14.3.2.2: PKH26 ve PKH6 Boyasının Tutulması

ICSC’lerin yavaş çoğaldığı ve sessiz kaldığı bildirilmiştir. Bu CSC’ler bölündüklerinde iki yavru hücreyle sonuçlanır; biri gövdeye sahiptir (sessiz kalır) ve diğerleri çoğalır. PKH26 ve PKH6 iki lipofilik boyadır [21]. Bu tahlilde (Şekil 14.4), hücre zarları bu boyalarla etiketlenir. Bölündükten sonra her iki yavru hücre de bu boyaların eşit kısmını alır [21].

Şekil. 14.3 Yan popülasyon tahlili. Yan popülasyon tahlili, akış sitometrik analizinden sonra hücrelerin yan popülasyon yüzdesini ölçer. Adımlar, hücrelerin ayrıştırılması ve enzimatik sindirimi yoluyla hücrelerin tek hücreli izolasyonunu içerir. Bu hücreler daha sonra Hoechst 33342 ile boyanır ve ardından hücreler akış sitometrik analizine tabi tutulur. CSC özelliklerine sahip hücreler, daha fazla ABC taşıyıcısına sahiptir ve hücrelerden dışarı akışlar boyanır ve bu hücreler, akış sitometrik grafiğinde yan tarafta elde edilir.

Hareketsiz olan CSC’ler, kök olmayan hücrelere kıyasla boyayı daha uzun süre tutar. Bu yöntem, CSC’leri meme kanserinden izole etmek için kullanılmıştır [22].

14.3.3: ALDEFLUOR Testi

Aldehit dehidrojenazlar (ALDH’ler), endojen ve eksojen aldehit substratlarının karşılık gelen karboksilik asitlere oksidasyonunu katalize eden enzim ailesine aittir [23]. Bu enzimler, fizyolojik metabolik ürünler veya kemoterapötik ajanlar gibi sitotoksik ilaçlar tarafından sentezlenen aldehitleri ortadan kaldırdıkları için detoksifikasyon özellikleri ile bilinirler.

Fig. 14.4 PKH26 boya tutma deneyi. Tek tabakalı kültür ilk önce PKH26 ile işlenir ve ardından yapışkan olmayan 3D kültüre tabi tutulur. Tek hücreli ayırmadan sonra, CSC’ler, düşük çoğalma potansiyeli nedeniyle boyayı uzun süre tutanlar olarak tanımlanır.

Bu detoksifikasyon özelliği, onları kanser hücrelerinde kemorezistans sağladıklarından kanser kök hücrelerinin bir belirteci olarak nitelendirir [24]. Hilton ve ark. ilk olarak yüksek ALDH aktivitesinin lösemi kök hücrelerinde siklofosfamide (bir alkilleyici ajan) karşı kemorezistanstan sorumlu olduğunu ortaya çıkardı [25]. Akciğer, kolon ve meme kanseri kök hücrelerinde artmış ALDH aktivitesi bildirilmiştir [21]. ALDEFLUOR testi, kanser kök hücrelerini tanımlamak için yapılır (Şekil 14.5). Bu tahlilde, yüksek ALDH aktivitesine sahip CSC’ler oldukça floresan hale gelir ve akış sitometresi kullanılarak saptanabilir ve hücre sınıflandırması kullanılarak izole edilebilir. ALDEFLUOR testi, BODIPY-aminoasetaldehit (BAAA) substratının bir floresan BODIPY-aminoasetat (BAA) ürününe dönüştürülmesi prensibi üzerinde çalışır [24]. Bu nedenle, bu tahlil, CSC’lerin içsel fonksiyonel özelliği temelinde CSC’leri izole eder.

14.3.3.1: İki Boyutlu Model

İki boyutlu kültürlenmiş tümör hücre hatları, kanserin ilerlemesini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. 2D kültürlenmiş tümör hücre hatları kullanılarak çeşitli sinyal yolları incelenmiştir. Ancak, tümör progresyonunu incelemek için teknolojideki ilerleme ile, 2D kültürlenmiş tümör hücre hatlarının kültür koşulları ve hücre pasajlarının sayısı nedeniyle çelişkili sonuçlar verdiği bildirilmiştir [26]. 2D kültürlenmiş tümör hücre dizilerini kullanan araştırmalar pahalı olmasa da, bunlar katı tümör modellerinin üç boyutlu özelliklerini ve ayrıca tümör mikro-ortamını taklit edemez. Bu nedenle araştırmacılar, kanser hastalarının sağkalımını iyileştirmek için daha doğru terapötiklerin geliştirilebilmesi için katı tümör özelliklerine benzeyebilecek üç boyutlu tümör modelleri geliştirdiler (Tablo 14.1).

Fig. 14.5 ALDEFLOR testi. Bu tahlil, kültürlenmiş hücrelerin BODIPY-aminoasetaldehit (BAAA) substratı ile muamele edilmesini içerir ve CSC’ler, BAAA’yı yüksek oranda floresan BAA’ya dönüştüren yüksek ALDH aktivitesi temelinde tanımlanır ve izole edilir.

14.3.3.2: Üç Boyutlu Modeller

Üç boyutlu tümör kültürleri, özellikle CSC’leri oluşturmak ve izole etmek için teknolojinin son ilerlemesidir. 3D modellerin temel amacı, tümör mikroçevresinin gen ekspresyon analizi, patogenez ve kemo direncin üstesinden gelmek için etkili ilaç testi üzerindeki etkisini incelemektir. Bu bölümde tartışılan iki önemli 3D tümör modeli, tümör sferoidleri ve tümör organoidleridir.

14.3.4    Küre Oluşumu Deneyi

14.3.4.1    Tümör Sferoidleri

Tümör sferoidleri, kendi kendini yenileme kapasitesine sahip tümör hücrelerinin küresel kümeleridir ve küre oluşturma deneyi ile üretilir (Şekil 14.6). Yapışkan olmayan 3D kültür olarak da bilinen küre oluşumu tahlili, ilk olarak yetişkin kök hücrelerini incelemek için bir yaklaşım olarak tanımlanmıştır [32].

Tablo 14.1 İki boyutlu hücre dizileri ile üç boyutlu sferoidler ve organoidlerin avantajları ve dezavantajları arasındaki temel farkların çizimi

Bu tahlilin prensibi, kanser kök hücrelerinin uygun olmayan koşullarda bir küre oluşturacak şekilde çoğaldığı ve kök olmayan hücrelerin anoikis için gideceğidir. Küre oluşumu tahlili, tümör ve kanserli hücrelerde bulunan kök hücre benzeri özelliklere erişmeyi sağlayan güçlü bir araçtır. Kanser kök hücreleri, serumsuz, yapışmayan kültür koşullarında büyütüldüklerinde, in vitro 3D (üç boyutlu) küreler oluşturma yeteneğine sahiptir [33]. Kanser kök hücreleri elde etmek için çeşitli 3D in vitro küre oluşumu deneyleri geliştirilmiştir. Bu tahlil, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile desteklenmiş ortam, agregasyonu önlemek için düşük yoğunluklu koşul, progesteron, heparin, insülin ve hidrokortizon içeren kök hücre benzeri koşullara benzeyen yapay bir ortamda hücrelerin büyümesini gerektirir [34]. Küre oluşumu tahlili, CSC’leri tespit etmeye yardımcı olduğu için yaygın olarak kullanılmaktadır ve ayrıca kendi kendini yenileme ve farklılaşma tek hücre düzeyinde çalışılabilir [32].

14.4: Kritik Parametre Değerlendirmesi

14.4.1    Hücre Yoğunluğu ve Klonal Oluşumu

Hücre yoğunluğu klonaliteyi doğrudan etkilediği için en önemli parametredir. Küre oluşumu analizinin merkezi odak noktası, her kürenin tek hücreden elde edilmesi ve bu nedenle klonal olması gerektiğidir. Farklı araştırma grupları, tohumlama için farklı hücre yoğunlukları önermiştir. Yüksek yoğunluklu tohumlama tercih edilmez çünkü küre füzyonu nedeniyle sonuçların yorumlanması çok zorlaşır. Küreler, hem içsel hem de deney kaynaklı hareket nedeniyle kümelenme potansiyeline sahiptir. Kürenin agregasyondan değil çoğalmadan oluşması sağlanmalıdır [32]. Bu nedenle, mikrolitre başına 0,2-20 hücrede tohumlama önerilir [35-37].

Şekil. 14.6 Küre oluşumu deneyi. Bu tahlilde, ilk olarak, ayrıştırma ve enzimatik sindirim yoluyla birincil tümörden tek hücreli süspansiyon oluşturulur. Daha sonra tek hücrelerin tohumlanması yapılır ve 1-4 hafta içinde küre oluşumu gerçekleşir.

14.4.2: Mitojen Toleransı

Kürelerin, yaklaşık 20 ng/ml’lik çok yüksek EGF seviyesinde kültürlendiği rapor edilmiştir. Bu yüksek EGF konsantrasyonu, kültürlenmiş hücrelerin farklılaşma potansiyelini değiştirebilir [32].

14.4.3: Kök Hücre Frekansının Fazla Tahmini

Küre oluşumu tahlili, üretilen kök hücrelerin sıklığını olduğundan fazla tahmin edebilir, çünkü FACS ile nöral kök hücre saflaştırması, hem kök hücrelerin hem de geçişi güçlendiren hücrelerin, nörosferlere yol açma potansiyeline sahip olduğunu göstermiştir [38]. Benzer bir yanlış okuma gözlemi, mammospheres oluşturan meme hücrelerinin kültürlenmesiyle de gözlemlendi [39].

14.4.4: Tümör Organoidleri

Tümör organoidleri, taze biyopsi örneklerinden oluşturulan avasküler tümöre benzeyen 3 boyutlu yapılardır [26]. Tümör organoid oluşumu süreci, tümör örneklerinin mekanik veya enzimatik işlenmesini ve kollajen veya Matrigels ve ECM ikameleri gibi hücre dışı matrise gömülmesini içerir [26, 40]. Tümör organoidini oluşturmak için kullanılan çeşitli adımlar Şekil 14.7’de gösterilmiştir.

Şekil. 14.7 Tümör organoid oluşumu deneyi. Hastadan alınan birincil doku, CSC’leri elde etmek için ayrıştırılır. Bu hücreler daha sonra tümör organoidi oluşturmak için üç boyutlu ortamda kültürlenir ve bu organoidler gerekli ilaç etkinliğini test etmek ve kişiselleştirilmiş ilaçlar geliştirmek için kullanılabilir.

Organoid teknolojisi son zamanlarda yaygın olarak kullanılmıştır ve mide kanseri organoidi, bağırsak kanseri organoidi, karaciğer kanseri organoidi, pankreas kanseri organoidi, meme kanseri organoidi, mesane kanseri organoidi ve prostat kanseri organoidi gibi çeşitli kanser organoidleri sentezlenmiştir [41-51].

14.5: Sonuç ve Diğer Yönergeler

Kanıtların bolluğu, mevcut kanser kök hücreleri teorisi ile uyumludur. CSC’lerin, tümör başlangıcında ve tümör ilerlemesinin sürdürülmesinde hayati bir rol oynadığı iyi bilinmektedir. Bu CSC’ler, orijin bölgesi dışındaki uzak bölgelere tümör metastazını kolaylaştırır. Bu nedenle, bu CSC’ler, tümör rejenerasyonu ve nüksetme potansiyeline sahiptir; bu nedenle, bunlar potansiyel terapötik hedeflerdir ve bu CSC’lerin ortadan kaldırılması, tümör tekrarını koruyacaktır. Etkili ilaç tedavisinin geliştirilmesi birincil amacı ile çeşitli teknolojik gelişmeler yapılmıştır. Geleneksel 2D kültür hücre dizileri, kanser tedavisini geliştirmek için uzun süredir kullanılmaktadır ve kanser araştırmalarına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Ancak bu 2D kültür hücre dizileri, bağışıklık sisteminin varlığında tümör gelişiminin durumuyla doğruluğu eşleştiremez; CSC’lerin stromal etkileşimleri ve ayrıca heterojenlik eksikliği, onları en az seçenek haline getirir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, kanser araştırmalarında 3D tümör modelleri modadır. Hem tümör sferoidleri hem de tümör organoidleri yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak tümör organoidleri kanser araştırmalarında devrim yaratmıştır ve in vivo gibi tüm tümörü özetledikleri için en iyi modeller olarak kanıtlanmıştır. Bu tümör organoid teknolojileri, kanser araştırmacılarına etkili ilaç testinin geliştirilmesine ve kişiselleştirilmiş tedavinin kolaylaştırılmasına yönelik bir yol sağlamıştır.

Bu nedenle, organoid teknolojisi, günümüzde mevcut olmayan en iyi cerrahi olmayan tedavi olacak kişiselleştirilmiş ilaç için yeni olanaklar potansiyelini desteklemektedir.

KAYNAKÇA: Cancer Stem Cells: New Horizons in Cancer Therapies, Editörler: Surajit Pathak Antara Banerjee